輔酶ⅠNAD（H）含量測試盒 常量可見分光光度法 說明 技術(shù) 文章

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輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒

商品貨號：QS1000
英文名稱：NAD(H) Kit
別名：輔酶Ⅰ含量測定試劑盒 NAD(H) Kit 輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒 輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒
檢測方法：常量法

• 產(chǎn)品詳細介紹
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• 產(chǎn)品說明書

測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

貨號：QS1000                                                      規(guī)格：50管/24樣                                     

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD⁺。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD⁺比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD⁺降解產(chǎn)物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

自備的實驗用品及儀器：

可見分光光度計、臺式離心機、移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體4 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃避光保存，用時加入4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃

        保存一周；  

試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃避光保存，用時加入4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保

        存一周；

試劑五：液體1.8mL×1支，4 ℃保存；

試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

NAD⁺和NADH的提取：

1 血清（漿）中NAD⁺和NADH的提取

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3 細胞或細菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，570nm下比色，讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值A(chǔ)2，計算△A=A2-A1。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應20min后再加試劑六。

3、反應過程中注意避光。

4、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒50管保證測24個NAD⁺或NADH.。

NAD⁺和NADH含量的計算：

（一）NAD⁺含量的計算

1、血清（漿）中NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099）

2、組織、細菌或細胞中NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W

 (3)按細菌或細胞密度計算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099）

（二）NADH含量的計算

1、血清（漿）中NADH含量計算

NADH含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065）

2、組織、細菌或細胞中NADH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065）

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

注意：低檢測限為1nmol/mL或1nmol/g鮮重 或0.01nmol/mg prot