蛋白酶抑制劑的選擇 應(yīng)用 使用 方法 說明

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羅氏蛋白酶抑制劑&磷酸酶抑制劑

cOmplete 是多種蛋白酶抑制劑的混合片劑：為水溶性片劑；同時(shí)持續(xù)抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等在內(nèi)的多種蛋白酶；可用于所有的組織及細(xì)胞，如動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌或真菌。

PhosSTOP 保護(hù)蛋白質(zhì)不發(fā)生去磷酸化反應(yīng)；可以抑制多種磷酸（酯）酶；適用于在細(xì)胞裂解過程中保護(hù)蛋白質(zhì)，并且可以適用于多種不同來源的樣品（哺乳動(dòng)物，植物，酵母）；可以結(jié)合cOmplete Lysis Kits 和 cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets一起使用；這種抑制劑藥片可用于緩沖福爾馬林（福爾馬林固定術(shù)）。

當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活，使電泳結(jié)果復(fù)雜化，影響終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在pH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。

但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來說，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線設(shè)計(jì)來說顯得尤為重要。

蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復(fù)雜的，通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”，見下表（來自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》）。

其實(shí)重要的是這種片劑操作方便：只要將一片completeTM 加進(jìn)緩沖液，便可抑制多種不同的蛋白酶，有效地保護(hù)目的蛋白，效果明顯，免除了稱量個(gè)別抑制劑的麻煩。而且complete Lysis 1個(gè)Kit20次反應(yīng)，定價(jià)為2167（Complete Lysis, bacterial II，其它類型價(jià)格差不多），高品質(zhì)，價(jià)格也不高，一舉兩得，何樂而不為呢？

另外MERCK在抑制劑生產(chǎn)提供方面也實(shí)力雄厚，旗下的各*有一千多種不同用途的抑制劑用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)組、細(xì)胞分化、神經(jīng)生物等諸多領(lǐng)域。其中也包含了分別適用于細(xì)菌、植物、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、重組蛋白、His融合蛋白等不同目的的蛋白酶抑制劑混合物，特異性抑制絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶活性的抑制劑混合物、堿性磷酸酶抑制劑混合物、酸性及堿性蛋白酶抑制劑混合物等等。

比如用于廣譜蛋白抑制的Protease Inhibitor Cocktail Set I是五種蛋白酶抑制的混合物，廣泛抑制多種不同蛋白酶及酯酶的活力，以凍干粉形式提供（每管以1ml水重溶，即可得1ml的100ⅹ儲液），方便保存。其它有針對性的蛋白酶抑制劑還有Protease inhibitor cocktail set II（細(xì)菌）、Protease inhibitor cocktail set III, EDTA-free（哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織）、protease inhibitor cocktail set IV（酵母及真菌）、Protease inhibitor cocktail set V, EDTA-free（哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織廣譜絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制劑）、Protease inhibitor cocktail set VI（植物）和Protease inhibitor cocktail set VII（His融合蛋白純化 ）。種類繁多，合適于有不同要求的實(shí)驗(yàn)人員。

除此之外，G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各種經(jīng)過濃度優(yōu)化后的蛋白酶抑制劑，具有良好的抑制廣泛物種蛋白純化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已經(jīng)發(fā)展成為大規(guī)模制備型，具有50ml和100ml的裂解緩沖液中使用的兩種規(guī)格。ProteCEASE分含有EDTA型，用于抑制金屬蛋白酶（metalloprotease）；和不含有EDTA型，用于維持依賴于二價(jià)陽離子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不會影響使用固相親和層析的蛋白純化，這種方便的形式具有強(qiáng)烈的蛋白抑制作用。

AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通過磺?；鞍酌富钚灾行牡囊粋€(gè)基團(tuán)，不可逆地抑制凝血酶thrombin和其他一些絲氨酸蛋白酶（chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin）。這種試劑是PMSF和DFP的低毒替代品，具有較高的水溶性，溶液狀態(tài)的pH為酸性，所以在這種pH下，穩(wěn)定性較高。

除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學(xué)機(jī)制的時(shí)候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個(gè)重要的步驟就是準(zhǔn)確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個(gè)重要保護(hù)過程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護(hù)。

磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況羅氏也推出了一種PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合片（可以與complete蛋白酶抑制劑兼容），這是一種即用型的片劑，其中的一些磷酸酶抑制劑只需要納摩爾級的量。無需花費(fèi)漫長的時(shí)間尋找合適的磷酸酶，也不必繁瑣的稱量和混合。PhosSTOP可同時(shí)持續(xù)抑制包括酸性和堿性磷酸酶，及絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在內(nèi)的多種磷酸酶。

而且PhosSTOP可應(yīng)用于多種細(xì)胞提取物中磷酸酶的抑制作用，包括對酸性和堿性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP也不會影響后繼的蛋白檢測（例如：western blot）或是蛋白濃度檢測 （例如：BCA或是Bradford）。

當(dāng)然提到磷酸酶抑制劑或者蛋白酶抑制劑，一個(gè)業(yè)內(nèi)*的做得相對不錯(cuò)的就是默克了，它的磷酸酶抑制劑混合物是以DMSO貯存液的形式，擺脫繁瑣的操作步驟，節(jié)約成本和時(shí)間，在效果方法能有效抑制劑蛋白樣本中的各種磷酸酶（酸性/堿性磷酸酶、絲/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸等），配方*公開，便于研究人員靈活應(yīng)用。

旗下產(chǎn)品包括：可抑制酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，可抑制絲/蘇氨酸磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set III，以及可抑制絲/蘇氨酸磷酸酶及堿性磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set IV。

總而言之，在實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)?shù)倪x擇一些經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控的產(chǎn)品，想來相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復(fù)性，和有效性，讓我們在下游應(yīng)用中得到更潔凈和清晰的結(jié)果。

但是這樣配置溶液進(jìn)行處理，有時(shí)也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡便操作，和抑制效果方面有不俗的表現(xiàn)，可以考慮在實(shí)驗(yàn)中選用，節(jié)約時(shí)間和便于結(jié)果分析。

比如，羅氏的Complete蛋白酶抑制劑混合片也許就能滿足這種需要，這種試劑能抑制很多種不同的蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等，而且可應(yīng)用于差不多所有的組織或細(xì)胞提物，包括來自動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌和直菌的樣品。

除此之外，Complete蛋白酶抑制劑混合片所有成份都穩(wěn)定和無毒，能提供安全和可靠的保護(hù)，這種混和片有不含EDTA的配方，這樣就更不會影響依賴金屬的蛋白的活性，并可確保有效進(jìn)行一些純化工作（如應(yīng)用Poly-His）標(biāo)記的蛋白）。