看完這些你就知道什么是TEV蛋白酶了

　　TEV蛋白酶是來源于煙草蝕紋病毒的nla蛋白酶中27kda的活性結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列。tev蛋白酶具有很強(qiáng)的位點(diǎn)特異性，能夠識(shí)別exxyxq(g/s)七氨基酸序列，常用序列的是glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly(或enlyfqg)，其切割位點(diǎn)在谷氨酰胺gln(p1)和甘氨酸gly(p1′)之間(即p1和p1’之間)，其序列專一性遠(yuǎn)比凝血酶、因子xa、腸激酶等蛋白酶高。
 

　　tev蛋白酶能夠耐受范圍廣泛的ph(ph4-8.5)和溫度(4-34℃)，對(duì)一些常見的增加蛋白可溶性或穩(wěn)定性的添加劑(乙二醇、egta、去垢劑以及還原劑)也都有不同程度的耐受。
 

　　有研究證明，tev蛋白酶對(duì)乙二醇、egta和一些除垢劑(tritonx-100、tween-20和np-40)不敏感，當(dāng)1%chaps存在時(shí)活性降低，在低濃度變性劑(2m尿素,1%sds)和還原劑(0.7mβ-巰基乙醇)中依舊可以保持大部分活性(c.sunetal.,2012)。
 

　　野生型tev酶在表達(dá)和溶解性等方面存在一定的缺陷，所以通過基因工程技術(shù)改良的突變體有大量報(bào)道。例如，天然的tev蛋白酶會(huì)發(fā)生自我切割，在表達(dá)和純化過程中，它會(huì)不斷由于其它tev蛋白酶的碰撞而發(fā)生構(gòu)象變化，在特定位點(diǎn)發(fā)生自我切割，從而使完整的蛋白酶被截短，活性大大降低。
 

　　lucast等人找到的s219n突變體，穩(wěn)定性得到很大的提高，但是可溶性并不高，有大約95%的蛋白是以包涵體的形式存在于沉淀中。kapust等人使用基因工程點(diǎn)突變了天然tev蛋白酶的基因序列，得到s219v這一穩(wěn)定性較高并且酶活性也有稍微提高的突變體，其穩(wěn)定性比s219n要高出約100倍。
 

　　其次，tev蛋白酶表達(dá)產(chǎn)量不高，溶解度也非常低。大約只有5%的tev蛋白酶存在于細(xì)胞破碎液的上清中，產(chǎn)量為12.5mg/l。
 

　　vandenberg等人通過基因改組(dnashuffling)、易錯(cuò)pcr(error-pronepcr)發(fā)現(xiàn)了一種可以將產(chǎn)量提高到54mg/l的突變體tevsh，其溶解度比s219n有很大提高，并且酶活性變化不大。cabrita，l.d.等人使用popmusic軟件設(shè)計(jì)，對(duì)tev蛋白酶單點(diǎn)突變體進(jìn)行穩(wěn)定性分析，篩選出了五個(gè)突變體，它們的可溶性和酶活性相對(duì)于野生型tev蛋白酶都得到提升，同時(shí)還得到一個(gè)雙突變體，其可溶性及酶活性相對(duì)于單突變體有顯著提高。
 

　　針對(duì)tev蛋白酶本身的缺點(diǎn)，研究者一直在尋找改良的突變體。例如，tevser135gly突變體比wt更穩(wěn)定，可以耐受對(duì)更高的溫度(>40℃);還有一些突變(t17s，n68d，n177v)可以顯著提高tev蛋白酶的溶解性。