Fura 2-AM鈣離子熒光探針|*

鈣離子熒光探針Fura 2-AM

規(guī)格：F015: 1 mg

 F025: 50 μg×8

F025: 50 μg

供應商：上海索寶生物科技有限公司

產(chǎn)品特性

Fura 2是常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一，Fura 2-AM(鈣離子熒光探針)需用無水DMSO(anhydrous DMSO)溶解。

Fura 2對Quin 2的熒光特性做了改進。1 μM Fura 2結(jié)合后的信號強度相當于30 μM的Quin 2結(jié)合后的信號強度。這樣就保證在實驗中可以使用比Quin 2的濃度低得多的Fura 2指示劑。Fura 2是一種使用廣泛的比率測量的鈣熒光指示劑。目前適用于Fura 2實驗的設(shè)備有很多，它特別適合于用數(shù)字成像顯微鏡來檢測。它比Indo 1更不易受到光褪色作用的影響。細胞形狀的改變有時候會影響340 nm和380 nm的熒光比率，比如，平滑肌收縮會同時引起這些波長的熒光信號強度的減小。另外，對于血管來說，340 nm的信號強度的增加會因為血管收縮而趨向于變小，而380 nm信號強度的減小會因為血管收縮而變大。Fura 2-AM是Fura 2的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易地負載到細胞中。

Fura 2可以和鈣離子(Ca²⁺)結(jié)合，結(jié)合鈣離子后在330-350 nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較強的熒光，而在380 nm激發(fā)光下則會導致熒光減弱。這樣就可以使用340 nm和380 nm這兩個熒光的比值來檢測細胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。

Fura 2-AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。Fura 2-AM的熒光比較弱，大激發(fā)波長為369 nm，大發(fā)射波長為478 nm，并且其熒光不會隨鈣離子濃度改變而改變。Fura 2-AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fura 2，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fura 2和鈣離子結(jié)合后，大激發(fā)波長為335 nm(大激發(fā)波長隨離子濃度的的不同而有所不同)，大發(fā)射波長為505nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為510 nm。如果做雙波長檢測，則推薦使用的激發(fā)波長為340 nm和380 nm。

操作說明 (for NG 108-15/ Neuronal Cell Line)*
試劑:
1 mM 的Fura 2-AM/DMSO (將1 mg 的Fura 2-AM 溶于 1 ml DMSO)
Hanks'balanced salt solution (HBSS)
HEPES buffer saline (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 13.8 mM glucose, pH 7.4)

操作:

1. 用含有5%的胎牛血清的DMEM在玻璃底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞。
2. 將培養(yǎng)液換成1 mM的 dibutyl cAMP/DMEM，再培養(yǎng)細胞3-4天來誘導樹突。
3. 用HEPES buffer saline來稀釋1 mM 的Fura 2-AM DMSO溶液，制成1μM的Fura 2-AM   working

solution。
4. 除去培養(yǎng)液，加入0.5 ml 的Fura 2-AM working solution。
5. 培養(yǎng)20分鐘，然后除去Fura 2-AM working solution。
6. 用HEPES buffer saline洗滌細胞一次，然后將細胞在HEPES buffer saline中培養(yǎng)1小時。
7. 將此細胞用于熒光鈣離子檢測。
8. 激發(fā)波長380 nm（游離鈣）和340 nm（結(jié)合鈣），發(fā)射波長510nm。
*標記的條件因細胞種類而異，在每次實驗前，請先確定佳條件。以上方法僅供參考。

染色實例1：

視網(wǎng)膜雙極細胞鈣離子濃度定標測定

（A）分離的視網(wǎng)膜雙極細胞預孵育2 ug/ml 的Fura-2 AM 20分鐘，且存在有ionomycin時，分別在無鈣、10 mM游離鈣離子以及用無鈣液洗脫的溶液中的圖像；（B）雙極細胞不同區(qū)域（1～3）的胞內(nèi)鈣離子濃度變化的連續(xù)記錄圖。10 mM游離鈣離子溶液可使雙極細胞胞體和軸突終末鈣離子濃度顯著升高，并可部分洗脫。

圖像處理軟件SimplePCI6，CCD Hamamatsu ORCA-ER，顯微鏡Olympus倒置顯微鏡IX70，40倍油鏡。

染色實例2：

加載了Fura 2的新鮮分離的大鼠肝臟細胞PE刺激后出現(xiàn)規(guī)則胞漿鈣振蕩，上圖為細胞明場圖和不同時間點（min）的比例成像（F340/F380）,下圖為影響Fura 2熒光強度的比例（F340/F380）隨時間的變化。成像系統(tǒng)：Photon Technology International Inc.,顯微鏡Nikon TE2000U，CCD相機QuantEM512S，軟件ERP。

染色實例3：

左圖（Control）為施加高鉀（50 mM）前，急性分離的大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞胞內(nèi)鈣離子濃度較低，施加50 mM KCl 5s后，DRG細胞內(nèi)鈣離子濃度快速升高（右圖）

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